单载体一体化系统：U6驱动sgRNA、EFS启动Cas9、P2A-Puro嘌呤霉素筛选标记；BsmBI酶切插入sgRNA；配套包装质粒：psPAX2、pMD2.G（三质粒慢病毒包装） 。

PiggyBac 双质粒共转染+稳筛实验操作方案--仅供参考，1. 质粒准备- PB Dual promoter 目的载体（携带你的外源基因、Puro+GFP）- Super PiggyBac 转座酶辅助质粒

实验菌株：大肠杆菌（如MG1655、BW25113等） 辅助质粒：- pKD46 ：表达λ Red重组酶（Exo、Bet、Gam），温度敏感型复制子，氨苄抗性 pKD3 ：氯霉素抗性模板质粒，需在pir⁺菌株中保藏 pCP20 ：表达FLP重组酶，温度敏感型复制子，氨苄/氯霉素双抗性 试剂：- 抗生素：氨苄青霉素（Amp, 100 mg/mL）、氯霉素（Cm, 25 mg/mL） 10% L-阿拉伯糖（诱导Red重组酶表达） 无抗LB液体/固体培养基、含相应抗生素的LB培养基 高保真DNA聚合酶、PCR引物、DpnI限制性内切酶 感受态制备试剂（10%甘油、预冷的超纯水）

使用pCRISPR 42875 和pCas9  42876敲除实验----仅供参考，通过Cas9切割+同源重组实现大肠杆菌基因敲除，核心流程为sgRNA构建→共转化→诱导重组→筛选鉴定→质粒消除  。

PLVX-Puro质粒包病毒流程 一、实验流程图解     A[Day 1：293T细胞铺板] --> B[Day 2：三质粒共转染]     B --> C[Day 3-4：病毒收集]     C --> D[靶细胞预实验]     D --> E[正式感染+嘌呤霉素筛选] 关键操作步骤图解

一，质粒功能与注射配比 | 质粒名称| 作用| 推荐注射量（成年小鼠） | |----------------------|-------------------------------------------------------------------------|--------------------------| | pT3-myr-AKT-HA   | 表达持续激活的AKT蛋白（致癌信号通路）| 5-10 μg | | pT/Caggs-NRASV12 | 表达突变型NRAS癌基因（驱动肝细胞恶性转化）| 5-10 μg| | pCMV(CAT)T7-SB100 | 表达Sleeping Beauty转座酶（介导质粒基因组整合）       | 1-2 μg（关键限速因子）|